·      Tarea 6

             PCR (Polymerase Chain Reaction)

             ¿Qué es la PCR?

 La reacción en cadena de la polimerasa es una técnica utilizada en laboratorios de bioquímica, genética, etc. que sirve para amplificar (aumentar la cantidad) de un fragmento de ADN. 

·         ¿Qué sustancias necesita?
1) Buffer
2) DNA molde (el que quiero amplificar)
3) Cebadores o primers (secuencias de DNA complementario)
4) Desoxinucleotidos (dNPTs)
5) Enzima: Taq polimerasa  

·         ¿Cómo se realiza?
Se introducen estas sustancias en un tubo. Este se coloca en un termociclador.
Primero se calienta el tubo a una temperatura de 95ºC. A esta T se desnaturaliza el ADN que se quiere amplificar y se abre en dos hebras.
Luego se desciende la temperatura hasta 52ºC para que se unan los cebadores a la hebra de DNA molde.
Por último se eleva la temperatura hasta 72ºC para que la Taq polimerasa se una y genere la hebra complementaria.
Este ciclo de 3 pasos se repite cerca de 30 veces y se obtiene un billón de veces el fragmento de DNA a amplificar. 

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

La reacción en cadena de la polimerasa, cuyas iniciales en inglés son PCR ("polymerase chain reaction" ), es una técnica que fue desarrollada por Kary Mullis a mediados de los años 80. Con esta metodología se pueden producir en el laboratorio múltiples copias de un fragmento de ADN específico, incluso en presencia de millones de otras moléculas de ADN. Como su nombre indica, se basa en la actividad de la enzima ADN polimerasa que es capaz de fabricar una cadena de ADN complementaria a otra ya existente. Sus únicos requerimientos son que existan nucleótidos en el medio que son la materia base para fabricar el ADN (los nucleótidos de adenina, timina, citosina y guanina), y una pequeña cadena de ADN que pueda unirse a la molécula que queremos copiar para que sirva como cebador (el cebador, en inglés “primer”).

La reacción en cadena de la polimerasa se desarrolla en tres pasos. El primero es la separación de las dos cadenas que forman la molécula de ADN que se quiere amplificar, para lo cual se debe calentar el ADN a altas temperaturas que pueden ser próximas a la ebullición. Cada una de estas cadenas actuará como molde para fabricar su complementaria. A continuación se baja la temperatura para conseguir que cada cebador se una a su región específica dentro de la cadena de ADN. El último paso consiste en la generación de la cadena de ADN complementaria por acción de la ADN polimerasa. El problema con el que se encontraron los científicos que idearon esta técnica es que es preciso aumentar la temperatura de la mezcla de reacción hasta valores por encima de los 70°C para que las dos cadenas de ADN se separen. A estas temperaturas tan elevadas la ADN polimerasa se inactivaba y era preciso añadirla de nuevo en cada ciclo. Esto fue así hasta que se descubrió la bacteria Thermus aquaticus que vive en aguas termales y cuya ADN polimerasa (Taq polimerasa) es capaz de trabajar a temperaturas superiores a los 70°C. De esta manera sólo hay que añadir la enzima al inicio del proceso de reacción y llevar a cabo tantos ciclos como sea necesario. Cada una de las moléculas de ADN hijas pueden volver a entrar en el proceso y servir como molde para fabricar más copias. Así tras 20 ciclos de reacción se puede obtener hasta 1 millón de copias de una molécula de ADN.